Иммобилизованные ферменты (от лат. immobiiis - неподвижный), препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитич. свойства. иммобилизованные ферменты обычно не раств. в воде. между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитич. реакции, ингибиторов и активаторов.
Существует неск. осн. способов иммобилизации ферментов: 1) путем образования ковалентных связей между
ферментом и матрицей; 2) полимеризацией мономера. образующего матрицу, в присутствии фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля. 3) благодаря электростатич. взаимод. противоположно заряженных групп фермента и матрицы; 4) сополимеризацией фермента и мономера. образующего матрицу; 5) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимод. - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.; 6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, например, включением фермента в липосомы. 7) сшиванием молекул фермента между собой, например, глутаровым альдегидом. диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты. Особый случай иммобилизации проведение ферментативных реакций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты реакции распределяются между орг. и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэф. распределения веществ между фазами сдвигать равновесие реакции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает пов-сть их раздела и тем самым улучшает доступ субстрата к ферменту.
Среди способов иммобилизации наиб. распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстрановые гели (сефароэу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетич. полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, например, бромцианом, азотистой кислотой или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, которые способны вступать в реакцию сочетания, взаимод. с группами NH2, ОН, СООН. Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид.
На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно неск. способами. Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами и матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварит. хим. модификации молекул фермента низкомол. веществами или растворимыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицир. белков электростатич. заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространств. затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицат. влияния матрицы между ней и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов - спейсер (наз. также "вставкой" или "ножкой"). Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естеств. микроокружение.
При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы не блокировали каталитич. центр фермента, а условия иммобилизации не приводили к потере его активности. Определенные ограничения на способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомол. субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель. Если матрица несет на себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетич. параметры реакции: разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость реакции, катализируемой иммобилизованные ферменты, одноименные заряды ее снижают и м. б. причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также на величину рН, при которой скорость ферментативной реакции максимальна.
Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и раствора. Ограниченная доступность субстрата к активному центру фермента может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это Характерно для высокомол. субстратов, которые из-за малого коэф. диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованные ферменты, что приводит к относит.
увеличению скоростей др. реакций с участием субстратов меньших размеров. В некоторых случаях возможно также изменение направления реакции. Так, фермент эндополигалактуроназа, катализирующий расщепление полигалактуроновой кислоты в середине молекулы, после иммобилизации отщепляет низкомол. фрагменты от концов молекулы. Существ. влияние на кинетику реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, оказывают два диффузионных барьера - внешний и внутренний. Первый обусловлен наличием тонкого неперемешиваемого слоя растворителя вокруг частицы иммобилизованного фермента (слоя Нернста). Толщина этого слоя зависит от скорости перемешивания. Поэтому увеличение последней или скорости тока раствора в колонке с иммобилизованными ферментами увеличивает скорость ферментативной реакции. Внутр. диффузионный барьер возникает вследствие ограничения своб. диффузии субстрата внутри сетки полимерной матрицы.
Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ. К ним относятся: более высокая стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакц. среды и его повторного использования, а также возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках. Важное значение имеет относит. стабильность иммобилизованных ферментов к денатурирующим воздействиям - нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и др. Последнему подвержены протеолитич. ферменты. Иммобилизация разобщает молекулы этих ферментов и полностью исключает такой процесс. Благодаря этому удалось изучить механизм образования протеолитич. фермента пепсина из его предшественника пепсиногена (при этом от последнего отщепляется пептид, состоящий из 42 аминокислотных остатков). Было показано, что эта реакция катализируется самим пепсином.
Иммобилизованные ферменты применяют в произ-ве L-аминокислот, 6-аминопенициллановой кислоты, из которой получают полусинтетич. пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, используемых больными с лактазной недостаточностью, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы и др. веществ, для создания аппаратов "искусств. почка" и "искусств. печень", для удаления эндотоксинов, образующихся в процессе заживления ран и ожогов, при лечении некоторых онкологии, заболеваний и др. Большое значение приобрели в клинич. и лаб. практике иммуноферментные методы анализа, в которых также используются иммобилизованные ферменты
Лит.: Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы, под ред. И. О. Березина, т. 1-2, М., 1976; Козлов Л. В., "Биоорганическая химия", 1980, т. 6, № 8, с. 1243-54; Введение в прикладную этимологию. Иммобилизованные ферменты, под ред. И. В. Березина, К. Мартинека, М., 1982; Тривен М., Иммобилизованные ферменты. Вводный курс и применение в биотехнологии, М., 1983. © Л. В. Козлов.
|
|
