главная > справочник > химическая энциклопедия:

Афинная хроматография

Аффинная хроматография (от лат. affinis - родственный) (биоспецифич. хроматография, хроматография по сродству), метод очистки и разделения белков, основанный на их избират. взаимод. с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем. В кач-ве лигандов используют соед., взаимод. которых с разделяемыми в-вами основано на биол. ф-ции последних. Так, при разделении ферментов (для чего преим. и применяется аффинная хроматография) лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты. Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии, состоит в том, что разделение основано на различии не физ.-хим. признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфич. функциональных свойств, отличающих данный фермент от множества др. биополимеров.

Неподвижная фаза в аффинной хроматографии представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме: носитель - соединяющее звено ("ножка") - специфич. лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или "ножки", содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом:

Содержание лиганда колеблется от 0,1 до 10 мкмоль на 1 г влажного сорбента. Сефароза, однако, малоустойчива к действию ряда хим. веществ и микроорганизмов.

Более стабильны макропористые неорг. носители (кремнезем, стекло) и орг. полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю, эффективность специфич. взаимод. с ферментом заметно снижается вследствие пространств. затруднений. "Ножка", как правило, устраняет стерич. препятствия, отдаляя лиганд от носителя. Как и носитель, она должна быть инертной и не влиять на процессы в ходе аффинной хроматографии, чего, однако, не всегда удается достигнуть. Напр., присоединение "ножки" по приведенной выше реакции приводит к образованию катионной группировки изомочевины, и сорбент приобретает свойства анионита. В кач-ве "ножки" используют обычно ди- и полиамины. аминокислоты. пептиды, олигосахариды.

Лигандами могут служить субстраты (напр., крахмал или гликоген при разделении амилаз), однако их превращ. в ходе аффинной хроматографии, катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет свойства сорбента. Поэтому, как правило, применяют аналоги субстратов, устойчивые к дальнейшему превращ., т.е. ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ используют не расщепляемые ими пептиды D-аминокислот. Эффективны прир. ингибиторы ферментов. например пепстатин - ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы). Примеры таких "группоспецифич." лигандов - антрахиноновые красители, аналоги никотинамидадениндину-клеотида.

Известны лиганды (напр., производные фенилборной кислоты), имитирующие при взаимод. с ферментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.

Разделение в аффинной хроматографии обычно проводят на хроматографич. колонках; иногда разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного связывания исследуемого компонента. Затем сорбент (в колонке или сосуде) промывают буферным раствором для удаления несвязавшихся веществ, после чего десорбируют исследуемый компонент. Десорбция (элюция) последнего обычно достигается повышением ионной силы, изменением рН буферного раствора или добавлением в него орг. растворителя, что ослабляет взаимод. лиганд - фермент. Более избирательна десорбция раствором лиганда.

Помимо ферментов. методом аффинной хроматографии можно выделять также токсины, рецепторы, ингибиторы, транспортные белки и др. биологически активные вещества. Высокой избирательностью отличается т. наз. иммуносорбция, при которой в кач-ве лиганда используют антитела, обладающие специфичностью к выделяемым белкам; особенно эффективны моноклональные антитела.

Для разделения белков применяется также ряд др. аналогичных методов. Т. наз. ковалентная хроматография основана на избират. образовании и последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым веществом и носителем. например между белком с SH-группами и ртуть-орг. производными агарозы. Применяется также лигандообменная хроматография, при которой ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном, иммобилизованным на носителе. Получила распространение гидрофобная хроматография, при которой сорбент (напр., фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки, вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками, содержащимися на пов-сти белков. Нередко при этом наблюдаются также ионообменные взаимод., как, напр., при использовании в качестве сорбента алкиламиносефароз.

Избират. выделение гликопротеинов обеспечивают иммобилизованные на носителях лектины - белки, специфически взаимодействующие с концевыми моносахаридными звеньями углеводных цепей. Иммобилизованные субъединицы ряда белков с четвертичной структурой м. б. использованы для извлечения этих белков из сложных смесей вследствие специфич. межсубъединичных контактов. Аффинная хроматография сформировалась как метод в кон. 60-х гг. 20 в.

Лит.: Туркова Я.. Аффинная хроматография, пер. с англ.. М., 1980. © В. М. Степанов.