Флуоресценция 1,8-АНС в средах различной полярности (калибровка)

физико-химические методы исследования, методики и другие вопросы аналитической химии
analytical chemistry, analysis and techniques for professionals
Ответить
Demiurg
Сообщения: 774
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Флуоресценция 1,8-АНС в средах различной полярности (калибровка)

Сообщение Demiurg » Чт окт 24, 2019 5:06 pm

Здравствуйте уважаемые участники форума!

Обращаюсь к Вам с просьбой оказать помощь в решении следующего вопроса:

- есть задача оценить полярность (выраженную в виде диэлектрической проницаемости) мест связывания флуоресцентного зонда 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты (1,8-АНС) на мембранах клеток (лимфоцитов, в частности).

Основа метода: зависимое от уменьшения полярности среды увеличение интенсивности флуоресценции этого зонда (со сдвигом максимума флуоресценции в коротковолновую область).Т.е. чем неполярнее окружение, тем сильнее (интенсивнее) флуоресценция.

Я решил построить калибровку по 1,8-АНС (в одной и той же концентрации) в средах различной полярности (спирты и их смеси). Идея не моя (из литературы), но не суть.

Калибровку попробовал построить (по диэлектрич. проницаемости) от 80 (вода) до 8,5. Концентрация 1,8-АНС - 5 мкМ. Длина волны возбуждения - 360 нм, флуоресценции - 480 нм (меня интересует именно изменение интенсивности флуоресценции на фиксированной длине волны, а не сдвиг максимума флуоресценции). 1,8-АНС вносился в использованные смеси растворителей в 96% этаноле, поскольку - уже начиная с бутанола - вода всё хуже и хуже смешивается с использованными (для получения смесей) растворителями. Конечная концентрация этанола в смесях составляла около 0,5%.

И вот что получилось:

в определённом диапазоне (от 80 до 15,3, т.е. от воды до изоамилового спирта) имеется вполне себе чёткая зависимость увеличения интенсивности флуоресценции от уменьшения полярности среды! А вот дальше что-то (непонятное для меня) произошло...

То ли тушение флуоресценции какое-то, то-ли ещё что...

В литературе есть примеры подобных калибровок до проницаемости в 10 (октанол-1).
Но у меня нет ни октанола, ни гексанола. Только изоамиловый спирт (15,3). Всё, что дальше в калибровке - на основе смеси изоамила и н-гептана.

Измерение выполнялось в 96-луночном планшете (из полимерного материала; какого именно - не знаю, сам планшет чёрного цвета для флуоресцентных измерений) на планшетном ридере-флюориметре. Кюветного (чтобы сделать это в кварцевой или стеклянной кювете) флюориметра в наличии нет...

Может это гептан как-то взаимодействует с материалом планшета?

Но визуально никаких изменений нет (стенки и дно лунок планшета "не растворяются" и не набухают, смесь растворителей не окрашивается).

Или гептан с самим зондом как-то взаимодействует?

Поскольку измерение делается в планшете, то нет возможности взять что-то другое (углеводороды, их производные, этилацетат, ацетонитрил и т.д.), поскольку будет "растворяться" и набухать материал планшета.

Спасибо!
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Allex'
Сообщения: 263
Зарегистрирован: Пт ноя 03, 2006 1:36 pm

Re: Флуоресценция 1,8-АНС в средах различной полярности (калибровка)

Сообщение Allex' » Ср ноя 20, 2019 2:13 pm

Объяснений может быть несколько, как минимум два :)
1. 1,8-АНС плохо растворяется в гептане, следовательно часть его либо выпадает в осадок (который не флуоресцирует), либо образует растворимые аггрегаты (в простейшем случае - димеры, которые тоже не флуоресцируют, либо флуоресцируют в другой области спектра) при увеличении содержания гептана в изоамиловом спирте.
2. Спектр поглощения и/или флуоресценции в неполярных средах сдвигается, поэтому на 480 нм виден только хвост флуоресценции, т.е. это видимость уменьшения интенсивности флуоресценции.
3. Реальность всегда сложнее, поэтому, скорее всего, обе причины присутствуют, каждая со своим вкладом в общее дело :beer:

Аватара пользователя
bigM
Сообщения: 4949
Зарегистрирован: Ср фев 15, 2017 2:05 am

Re: Флуоресценция 1,8-АНС в средах различной полярности (калибровка)

Сообщение bigM » Чт ноя 21, 2019 12:13 am

а покупку необходимых спиртов не рассматривали, они вроде недороги?
Не красота спасёт мир, а транквилизаторы.

Demiurg
Сообщения: 774
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: Флуоресценция 1,8-АНС в средах различной полярности (калибровка)

Сообщение Demiurg » Чт ноя 21, 2019 5:40 pm

Спасибо!

Попробую разобраться на основе Ваших предположений!

Я попробовал убрать гептан (грешил на него) в смеси с изоамилом, заменив его на н-октанол (октанол-1), вплоть до "чистого" октанола. Ситуация повторилась (начиная с 90% изоамила и 10% октанола). Причём флуоресценция тушится и в чистом октаноле (хотя авторы методики, на которой я и основываюсь, используют "чистый" октанол - диэлектрическая проницаемость 10,3). В авторской методике используются вода, этиленгликоль, метанол, этанол, пропанол-1, бутанол-1, изопропанол, бутанол-1, изобутанол, н-гексанол и н-октанол.
Изобутанола и н-гексанола у меня нет (заказать можно, конечно, но не скоро удастся их получить "в руки", особенно если их нет у местных посредников на складах и придётся ждать "из-за бугра"), но вот октанол-1 есть. Но флуоресценция "тушится" и в нём (та, которая на 480 нм).

Ещё раз спасибо!

Allex'
Сообщения: 263
Зарегистрирован: Пт ноя 03, 2006 1:36 pm

Re: Флуоресценция 1,8-АНС в средах различной полярности (калибровка)

Сообщение Allex' » Пт ноя 22, 2019 12:17 pm

Выскажу ещё некоторые соображения по поводу измерений. Подбор растворителей, хоть это и авторская методика, на мой взгляд выглядит странно.
Одна из проблем - это наличие воды в спиртах, содержание которой практически наверняка у Вас и у авторов статьи было разным, так как это нужно специально контролировать, а сушкой их до безводного состояния наверняка никто не заморачивался.
Логичнее было бы взять смесь диоксан-вода и построить на ней всю калибровку, чтобы не было перескоков с одного спирта на другой (и диапазон получился бы шире). Кстати, там что-то напутано с концентрациями метанола в воде, но это скорее всего опечатки. Материал планшета, скорее всего, полистирол, рискну предположить, что в 90%-ном водном диоксане (ДЭП ~6, что даже немного выходит за рамки измерений с Вашими смесями растворителей) заметного набухания планшета, отражающегося на результатах, за время измерения не произойдёт.
Есть ещё одна неприятная вещь - адсорбция красителя на стенках кюветы. Особенно это заметно на малых концентрациях (Ваш случай) и даже в стеклянных кюветах. Что-то мне подсказывает, что на полистироле эта адсорбция будет в разы выше, чем на стекле, особенно если растворитель плохо растворяет этот краситель. По идее, 90%-ный диоксан, несмотря на низкую ДЭП, должен растворять АНС намного лучше, чем смесь изоамилового спирта с гексаном. Понятно, что краситель, адсорбированный на стенке уже не поглощает и не флуоресцирует, соответственно интенсивность флуоресценции падает.
Всё вышесказанное всего лишь мои соображения, не претендующие на полное решение заданного вопроса. Их просто можно тоже принять к сведению. :235:
P.S. Про чистый октанол не знаю, что и сказать. Может его плохо посушили?

Ответить

Вернуться в «аналитическая химия / analytical chemistry»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 12 гостей