HPLC окисленных форм метионина

физико-химические методы исследования, методики и другие вопросы аналитической химии
analytical chemistry, analysis and techniques for professionals
Ответить
kika
Сообщения: 7031
Зарегистрирован: Ср окт 04, 2006 1:59 pm

HPLC окисленных форм метионина

Сообщение kika » Пт апр 17, 2020 3:14 pm

Здравствуйте, коллеги!
На НРLС проводим анализ смеси, в которой присутствуют соединения 1., 2. и 3. Соединение 1. имеет наименьшую полярность. Соединения 2. и 3. будут более полярными, чем 1.
Но интересно узнать, какое из соединений 2. или 3. будет иметь бóльшую полярность между собой.
Заранее спасибо за ваше мнение!
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.
Последний раз редактировалось kika Пт апр 17, 2020 7:59 pm, всего редактировалось 1 раз.

Аватара пользователя
Phobos
Сообщения: 6568
Зарегистрирован: Чт авг 12, 2004 9:24 am

Re: HPLC

Сообщение Phobos » Пт апр 17, 2020 5:15 pm

Сульфоксид должен быть по идее полее полярный, чем сульфон. Можно сравнить растворимость в ряду диметил сульфид - сульфоксид - сульфон. ДМСО с водой смешивается, сульфон растворим хорошо, но не бесконечно.
Wodka trinkt man pur und kalt, das macht hundert Jahre alt!

kika
Сообщения: 7031
Зарегистрирован: Ср окт 04, 2006 1:59 pm

Re: HPLC

Сообщение kika » Пт апр 17, 2020 6:46 pm

Спасибо большое!

Аватара пользователя
Phobos
Сообщения: 6568
Зарегистрирован: Чт авг 12, 2004 9:24 am

Re: HPLC

Сообщение Phobos » Пт апр 17, 2020 7:03 pm

Емнип, я когда-то окислял сульфид в сульфон и по ТСХ тоже было видно, что сульфоксид самый полярный из них.
Wodka trinkt man pur und kalt, das macht hundert Jahre alt!

vmu
Сообщения: 221
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: HPLC

Сообщение vmu » Пт апр 17, 2020 7:29 pm

В статьях USP и Eur.Ph. последних изданий есть ВЭЖХ методика на примеси в метионине.
Колонка: C18, 250 мм x 4.6 мм, 5 мкм.
ПФ А: 0.025 М H3PO4 в смеси вода/ацетонитрил 99.5 : 0.5.
ПФ Б: 0.025 М H3PO4 в смеси вода/ацетонитрил 52.5 : 47.5.
Градиент: 0-6 мин 0% Б, 6-50 мин подъем от 0 до 100% Б, 50-60 мин 100% Б, далее возврат к начальной ПФ.
Поток 1 мл/мин, температура 30 градусов. УФ детектор на 205 нм.
Время удерживания метионинсульфоксида - около 2.5-3 мин, метионина - около 5-6 мин.
Хроматограмма этих двух компонентов есть тут:
https://extranet.edqm.eu/4DLink1/4DCGI/ ... /mono/1027
После 6 мин идут более гидрофобные примеси типа N-ацетилметионина.

Метионинсульфон должен удерживаться чуть дольше метионинсульфоксида. Возможно неполное разделение.
Получайте хроматограммы индивидуальных веществ, и узнаете, где кто элюируется. Как минимум чистый метионин и более-менее чистый метионинсульфон у вас есть. Для количественной оценки содержания компонентов стандартные образцы примесей также не помешают.

P.S. Название темы могло бы быть более информативным.

kika
Сообщения: 7031
Зарегистрирован: Ср окт 04, 2006 1:59 pm

Re: HPLC

Сообщение kika » Пт апр 17, 2020 7:58 pm

Спасибо огромное, коллеги!
Стандарты окисленных форм метионина ждем.
На ВЭЖК окисленные формы метинина выходят очень близко друг у другу и хорошо разделены от метионина.
Было подозрение, что первый выходящий пик относится к метионин-сульфоксиду, потому что он в процессе окисления уменьшался. А теперь подозрение превратилось в уверенность. :) Спасибо!

P.S. Да, внесу коррективы в название темы.

StYV
Сообщения: 3080
Зарегистрирован: Пн окт 24, 2005 11:43 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение StYV » Пт апр 17, 2020 9:17 pm

Собирайте пики и делайте хромасс если доступно, сразу поймете что и как.

Аватара пользователя
Phobos
Сообщения: 6568
Зарегистрирован: Чт авг 12, 2004 9:24 am

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение Phobos » Сб апр 18, 2020 10:33 pm

2.5 - 3 минуты это вообще-то очень мало для разделения, вещество практически вылетает с фронтом растворителя.
Слышал про такую общую методику для полярных веществ - взять кислоту HClO4, приготовить раствор с pH =2, потом довести pH до 2.5 диэтиламином. Вроде как присутствие небольшого количества соли чуть увеличивает время удерживания и улучшает разделение.
Wodka trinkt man pur und kalt, das macht hundert Jahre alt!

vmu
Сообщения: 221
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение vmu » Вс апр 19, 2020 1:10 pm

Phobos, в описанных мной условиях мертвое время будет в районе 2.5 мин. Будем считать, что ровно 2.5 мин. Тогда, скажем, 2.7-3.0 мин - это уже какое-то удерживание. Слабое, но все же. Мало для разделения чего? Метионин и метионинсульфоксид там за километр разделяются. Метионинсульфоксид и метионинсульфон могут делиться не очень, но я видел хроматограмму в этих условиях, где эта пара пиков делилась с разрешением Rs 1.3 (времена удерживания веществ 2.72 и 2.86 мин). При сопоставимых размерах пиков сульфоксида и сульфона этого достаточно. Если пики сильно различаются по размерам, то этого будет маловато для количественного анализа (маленький пик будет съедаться большим пиком). С перхлоратом удерживание увеличится, разделение изменится. С таким же или с большим успехом в ПФ можно и другие анионные ион-парные агенты добавлять, например алкилсульфонаты. Либо вообще делить не на обращенно-фазовой колонке, а на катионообменнике.

Аватара пользователя
Phobos
Сообщения: 6568
Зарегистрирован: Чт авг 12, 2004 9:24 am

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение Phobos » Вс апр 19, 2020 3:36 pm

А как тут катионообменник поможет? Аминокислотная часть одинаковая у всех трех соединений, и окисление далекой серы никак не повлияет на ее кислотно-основные свойства.
Понятно, что сульфид неполярный и выйдет сильно позже. Сульфид и сульфон могли бы хорошо разделиться на других соединениях, но проблема именно в общей очень полярной аминокислотной части, которая всех толкает вперед со свистом, и еще и может дать размазывание пика из-за водородных связей. Вот их вроде как дополнительные соли в элуенте частично нейтрализуют.
Wodka trinkt man pur und kalt, das macht hundert Jahre alt!

vmu
Сообщения: 221
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение vmu » Вс апр 19, 2020 5:01 pm

Хвоста CH3-S-CH2-CH2- метионина вполне достаточно для приличного удерживания на колонке C18, даже несмотря на остальную полярную часть. Сульфоксид и сульфон с менее гидрофобными хвостами держатся слабее.

В кислой среде аминокислота - катион (-NH3+ группа). Катионообменная хроматография (обычно с послеколоночной дериватизацией нингидрином или орто-фталевым альдегидом) - один из основных методов аминокислотного анализа. См., например:
https://www.shimadzu.com/an/hplc/column ... ml#49-19-1
https://www.hitachi-hightech.com/global ... ana-la8080
http://femb.ru/femb/pharmacopea.php (ГФ 14, т. 1, Аминокислотный анализ, с. 693, 694, методы 1 и 2)
В обсуждаемой задаче можно обойтись УФ детектором без дериватизации. Естественно, ПФ при этом не должна содержать обычно используемого в ней цитрата и других веществ, которые поглощают УФ излучение в коротковолновой области.
На катионообменной колонке сульфон и сульфоксид будут удерживаться слабее метионина и будут отделяться от него. Как сульфон и сульфоксид будут делиться друг с другом, надо смотреть.
В целом проще делать на C18, а там по мере необходимости добавлять в ПФ хоть перхлорат, хоть октансульфонат.
Еще есть варианты типа HILIC или mixed-mode сорбентов (сорбентов с гидрофобными и ионообменными группами одновременно).

kika
Сообщения: 7031
Зарегистрирован: Ср окт 04, 2006 1:59 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение kika » Ср апр 22, 2020 8:35 am

StYV писал(а):
Пт апр 17, 2020 9:17 pm
Собирайте пики и делайте хромасс если доступно, сразу поймете что и как.
По NMR еще хотим попробовать определить сульфид получился или сульфон.

Аватара пользователя
Phobos
Сообщения: 6568
Зарегистрирован: Чт авг 12, 2004 9:24 am

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение Phobos » Ср апр 22, 2020 3:59 pm

Если есть ссылки на лит. спектр, с хорошо разделенными пиками - то хорошо. А если нет - получите пару синглетов на 2.3-2.5 и будете гадать, то ли это уже сульфон, то ли два изомера от сульфоксида...
Wodka trinkt man pur und kalt, das macht hundert Jahre alt!

kika
Сообщения: 7031
Зарегистрирован: Ср окт 04, 2006 1:59 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение kika » Ср апр 22, 2020 5:10 pm

А почему два изомера от сульфоксида - D и L?

vmu
Сообщения: 221
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение vmu » Ср апр 22, 2020 6:17 pm

(S,S) и (S,R) диастереомеры сульфоксида.
Первая буква - конфигурация α-атома углерода (S = L-конфигурация, если у вас природный метионин, а не рацемат или D-метионин).
Вторая буква - конфигурация атома серы с четырьмя разными заместителями (метильная группа, кислород, аминокислотный хвост и свободная электронная пара атома серы).

kika
Сообщения: 7031
Зарегистрирован: Ср окт 04, 2006 1:59 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение kika » Ср апр 22, 2020 9:09 pm

Спасибо большое за объяснения!
У продукта получился такой NMR - рисунок прилагаю.
Пока разбираюсь, сульфоксид это или сульфон...
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

vmu
Сообщения: 221
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение vmu » Ср апр 22, 2020 10:30 pm


kika
Сообщения: 7031
Зарегистрирован: Ср окт 04, 2006 1:59 pm

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение kika » Чт апр 23, 2020 6:00 pm

Спасибо большое!
Да, очень похожи, но вот этот высокий пик все же больше приближает
мою мысль к тому, что получился сульфоксид, причем на удивление чистый.

Аватара пользователя
Phobos
Сообщения: 6568
Зарегистрирован: Чт авг 12, 2004 9:24 am

Re: HPLC окисленных форм метионина

Сообщение Phobos » Пт апр 24, 2020 1:32 am

Сходные, но все же сульфоновые пики больше сдвинуты влево. Метильный синглет сульфона на 3.1 аж уехал, а сульфоксидный где-то 2.75.
Wodka trinkt man pur und kalt, das macht hundert Jahre alt!

Ответить

Вернуться в «аналитическая химия / analytical chemistry»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: Google [Bot] и 15 гостей