Нингидриновая проба

[сталкер499]

Уважаемые коллеги, день добрый!
Требуется Ваша помощь. Сразу хочу сказать, что ни разу не химик (в хорошем смысле этого слова), поэтому, если возникнут невнятность или косноязычие в попытках объяснить чего хочу, не кидайтесь тяжелыми предметами, стремясь попасть мне в голову…
Занимаемся переработкой масел и жиров – рафинацией и дезодорацией. С растительными маслами проблем нет – вещества, придающие маслам характерные вкусы и запахи, хорошо и прогнозируемо возгоняются в процессе вакуумной дистилляции.
Вопросы возникли при рафинации топленых животных жиров.
По ряду косвенных признаков, думаю, что в жирах присутствуют вещества белковой природы (некоторое потемнение, вроде как реакция Майяра). Ответ на этот вопрос привел к интересному наблюдению.
Попытка качественно определить наличие веществ белковой природы в водных отстоях технологических процессов, с использованием 0,2% р-ра нингидрина в ацетоне, привела к следующему результату: после обработки топленого жира раствором Na2HPO4 в воде, подготовленной на установке обратного осмоса, водная фаза отстоя, при слаборозовой пробе на фенолфталеин, дала желтый окрас. Такой цвет растворов описывается в литературе, как качественная реакция на присутствие веществ также белковой природы - пролинов и оксипролинов.
Радость «пытливого ума» была недолгой: оказалось, что это сам водный р-р гидрофосфата натрия, дал такой цвет.
Сам вопросы: как так получается? Где ошибка или заблуждение?
Вода, используемая для приготовления р-ров, на нингидриновую пробу «молчит».
Заранее благодарен за любой ответ.

[avor]

Что бы нингидриновая проба нормально работала белок надо гидролизовать до аминокислот. Сам по себе белок, да еще в низкой концентрации окраски практически не дает. По поводу окраски либо у вас нингидрин не очень либо фосфат загрязнен аминами

[сталкер499]

Уважаемый Avor, спасибо за ответ.
Раствор нингидрина предварительно протестировался на водном р-ре яичного белка, цвет которого изменился на фиолетовый. Я, читая материалы форума, так или иначе посвященные белкам, хватаюсь за голову: как в производстве соблюсти этот сонм условий, позволяющий экстрагировать неизвестно какие белки в водную фазу?
В какой среде - изоэлектрической, кислой или основной - можно добиться максимального извлечения белков и продуктов их распада из жирового сырья?
На вопрос об определении состава и количества белковых соединений, институт мясной промышленности ответил, что в топленых жирах такой анализ не возможен.
Подскажите, хотя бы на вскидку, что бы можно было попробовать?

С искренним уважением.

[avor]

--Раствор нингидрина предварительно протестировался на водном р-ре яичного белка, цвет которого изменился на фиолетовый.
К сожалению яичный белок - это не чистый белок, а сложная смесь и аминокислот и солей и аминов и витаминов белков.
Белки растворимые в жирах это весьма редкий случай. Наиболее вероятный вариант нахождения белков в саломассе это нахождение в водной фазе. Если саломасса вытапливалась при температуре 100 и выше градусов цельсия, 95 и более процентов белка необратимо денатурировало - это означает перешло в нерастворимую форму, при чем нерастворимую ни в жирах, ни в воде.

[hongma]

Итак, вы хотите определить содержание белка в некой смеси, в которой основной компонент это жиры?
Если так, то для начала отделяем жиры от белков. Первые растворимы в неполярных растворителя (эфир, хлороформ, гексан и тп), вторые - главным образом в воде (немного в спирте, водосодержащем ацетоне, ацетонитриле и тп).
Можно предложить несколько вариантов.
1. экстрагировать жиры эфиром, ацетоном, гексаном - белок даст нерастворимый остаток, который растворим в воде или лучше в слабом растворе щелочи
2. экстрагировать белки водой

Затем в водном растворе определить белок биуретовым методом. Этот метод не самый чувствительный, но зато самый "дубовый" из простых - дает близкие результаты для большинства белков.
Более геморройно и менее специфично определение по Кьельдалю - определяются все вещества с азотом, а это не только белки. Лучше брать вариант с фотометрическим определением фенол-гипохлоритом.

[сталкер499]

Уважаемые Avor и hongma, день добрый!

Спасибо Вам за ответы.
Если есть у Вас такая возможность, пообщаться по e-mail, то я бы отписался о своих "достижениях" более подробно, т.к. тут, все-таки, форум и объемный "плач Ярославны", не думаю, что приветствуется.
Я на stalker499@mail.ru. Если такой возможности нет, то попытаюсь как-то эссенциализироваться в текстах.

С благодарностью.

[Ясень]

Из собственного опыта - реактив Фолина-Чокальтеу на порядок превосходит нингидриновый метод

[hongma]

Если не стоит задача достичь максимальной чувствительности, биуретовый вне конкуренции.
Именно потому, что самый дубовый, посторонние влияния минимальные. А здесь вполне хватит его предела количественного определения порядка 0,1 г/л.
Что же касается фракционного состава белка, то ответ на ваш вопрос довольно странен. Неужели в институте мясной промышленности не знают слова "электрофорез"?

[Ясень]

Если не стоит задача достичь максимальной чувствительности, биуретовый вне конкуренции.
Именно потому, что самый дубовый, посторонние влияния минимальные. А здесь вполне хватит его предела количественного определения порядка 0,1 г/л.
Что же касается фракционного состава белка, то ответ на ваш вопрос довольно странен. Неужели в институте мясной промышленности не знают слова "электрофорез"?

Так нет у них белка в растворе. Совсем мало. Им метод Фолина нужен для микроколичеств или упарить пробу

[hongma]

В топленом масле достаточно белка. Тем более, что пооизойдет концентрирование.
Методика:
Берем 1 г масла, смешиваем с 10 мл ацетона, центрифугируем. Осадок промываем несколько раз по 1-2 мл ацетона до полного удаления липидов. Остаток растворяем в 0,1 мл 1% гидроксида натрия или карбоната натрия. Определяем в полученном растворе белок и результат умножаем на 10 - получаем белок в исходном масле.

[chemist]

В топленом масле достаточно белка. Тем более, что пооизойдет концентрирование.

Произойдёт ли концентрирование неизвестно, а вот денатурация точно случится и все свободные NH2-группы, ответственные за нингидриновую реакцию, будут заблокированы (денатурация, см. выше сообщение коллеги avora). Такой белок определяться уже не будет, нужен глубокий гидролиз до аминокислот.

[hongma]

Знаете, ни разу не сталкивался с затруднениями при проведении нингидриновой пробы из-за денатурации. И, кстати, ее активно применяют в гистологии, а там все при фиксации денатурирует еще как. И никто не пищит про необходимость особого обращения с образцами - годна любая фиксация.
Так что смело используйте биуретку и ничего не бойтесь - самый простой, дубовый и удобный метод.
И если она не поймает белок (что, повторяю, будет весьма удивительно - там его может быть до 0,2%), то можно считать, что его там и нет.
Тем более, что я изначально предлагал концентрировать белок - осаждение ацетоном тут наиболее удобный и универсальный метод. Ацетон можно брать хоть технический в количестве не менее, чем в 5 раз большем, чем объем исходного материала (твердого или жидкого - без разницы). Заодно отмываются жиры.

[avor]

Ну,если нингидрин и используют в гистологии, то не активно. И потом там фактически красят осадок, который потом рассматривают в микроскоп, а здесь нужно окрасить раствор, в котором весь гипотетически окрашиваемый агент в осадке - почуствуйте разницу.

То что у вас не было проблем, не означает, что их не будет в рассматриваемом весьма нестандартном случае.

Все реакции на белки с тараканами и биурет не исключение.

Смело пробовать можно что угодно. Вопрос только в том, как интерпретировать результат.

У автора на самом деле весьма вероятно проблема, скорее всего и не из-за белка. И вообще его проблема не как измерить белок,а как изменить технологию, что бы продукт был максимально бесцветным. Даже если окраска из-за белка, технологическое решение проблемы скорее всего будет такое же, как если бы это была любая другая водорастворимая примесь.

Так что споры по поводу способов измерения примеси белка в сем экзотическом объекте носит умозрительный абстрактный характер и имеет мало отношения к теме топика.

[hongma]

Да не переусложняйте
Возник вопрос у человека - не является ли нежелательная примесь белком. Я предлагаю достаточно простой и вполне надежный способ это выяснить. Даже если есть проблемы с организацией собственного исследования, вполне можно договориться с какой-нибудь лабораторией биологического или медицинского профиля и провести эту простенькую работу.
Кроме того, вопрос не столь уж неважен, как вы предполагаете. Наиболее вероятные кандидаты это белки или углеводы. От углеводов сравнительно легко можно избавиться промывкой водными растворами. В молоке полисахаридов практически нет. А вот с белками сложнее, особенно из молока. Многие из них достаточно липофильны и может понадобиться специальное исследования для определения хорошей технологии их удаления.

[avor]

Во первых сырье у автора не молочное, а костный жир. Во вторых пробовать можно все что хочется, как я писал выше, но вот как интерпретировать результат большой вопрос. Вообще в связи достаточной сложностью объектата искать и бороться с каким-то индивидуальным загрязнителем в такой ситуации - зря деньги тратить на ненужные тонкости, можно сразу переходить к поиску технологического решения в лаборатории, ибо спектр возможных загрязнителей огромен, а список технологических операций, позволяющий бороться с проблемой относительно ограничен.