Новости химической науки > РНК-аптамеры: антитела из нуклеиновых кислот

Аптамеры представляют собой короткие одноцепочечные олигонуклеотиды (ДНК или РНК), способные сворачиваться в уникальные трёхмерные структуры и связываться с молекулами-мишенями с высокой аффинностью и специфичностью, подобно антителам. В отличие от белковых антител, аптамеры синтезируются химически, что обеспечивает низкую стоимость, короткое время производства, низкую иммуногенность и возможность связывания даже скрытых эпитопов, недоступных для антител. Первым одобренным терапевтическим аптамером стал пегаптаниб (Macugen) — РНК-аптамер против VEGF, одобренный FDA в декабре 2004 года для лечения возрастной макулярной дегенерации. Сегодня аптамеры активно развиваются как терапевтические агенты и как распознающие элементы биосенсоров для диагностики широкого спектра заболеваний.

Идея использования нуклеиновых кислот в качестве молекул распознавания возникла из фундаментального наблюдения: одноцепочечные олигонуклеотиды способны образовывать сложные вторичные и третичные структуры — шпильки, внутренние петли, псевдоузлы и G-квадруплексы, — которые могут формировать сайты связывания, комплементарные по форме и распределению зарядов молекулам-мишеням.

Термин «аптамер» (от латинского aptus — «подходить», «соответствовать») был предложен в 1990 году для описания таких олигонуклеотидных лигандов. Концептуально аптамеры можно рассматривать как «антитела из нуклеиновых кислот»: подобно иммуноглобулинам, они распознают мишени с высокой специфичностью, но при этом обладают рядом принципиальных преимуществ, обусловленных их химической природой.

Ключевые преимущества аптамеров перед антителами включают меньший размер (8–15 кДа против ~150 кДа), что обеспечивает лучшее проникновение в ткани, возможность химического синтеза в килограммовых количествах по относительно низкой цене, низкую иммуногенность и возможность обратить их активность с помощью комплементарного олигонуклеотида-антидота.

Технология получения аптамеров, известная как SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment — систематическая эволюция лигандов путём экспоненциального обогащения), была разработана независимо группами Ларри Голда и Джека Шостака в 1990 году. Метод основан на принципах дарвиновской эволюции, реализуемых in vitro.

Процесс SELEX включает повторяющиеся циклы из четырёх этапов: инкубация случайной олигонуклеотидной библиотеки с мишенью, отбор последовательностей, связавшихся с мишенью, элюция связавшихся аптамеров и их амплификация для следующего раунда. После 5–15 раундов селекции получается пул последовательностей, обогащённых высокоаффинными связывателями, которые затем индивидуально тестируются и оптимизируются.

Стандартная библиотека для SELEX содержит случайный участок длиной 20–100 нуклеотидов, фланкированный консервативными последовательностями для праймеров, необходимыми для амплификации. Для РНК-аптамеров процесс включает обратную транскрипцию и in vitro транскрипцию на каждом раунде, что делает его более трудоёмким по сравнению с ДНК-SELEX.

Развитие метода привело к созданию множества модификаций: Capture-SELEX для малых молекул, CE-SELEX с использованием капиллярного электрофореза, Cell-SELEX для отбора аптамеров к целым клеткам, а также in vivo SELEX для мишеней в живых организмах. Применение секвенирования следующего поколения (NGS) в сочетании с биоинформатическим анализом позволило существенно ускорить идентификацию «победивших» последовательностей и отслеживать эволюцию пула аптамеров.

Нативные РНК-аптамеры крайне нестабильны в биологических жидкостях из-за быстрой деградации сывороточными нуклеазами. Решение этой проблемы потребовало химической модификации нуклеотидов, которая должна была не только повысить стабильность, но и сохранить способность к связыванию мишени.

Наиболее широко используемая стратегия — замена 2′-гидроксильной группы рибозы на фтор или O-метил. 2′-фтор-пиримидиновые нуклеотиды включаются в РНК в процессе транскрипции с использованием мутантных полимераз, способных распознавать модифицированные субстраты. После отбора аптамеры дополнительно модифицируются введением 2′-O-метил-пуринов, что ещё больше повышает устойчивость к нуклеазам.

Именно этот подход был использован при создании пегаптаниба — первого одобренного аптамерного лекарства. Пегаптаниб представляет собой 28-нуклеотидный РНК-аптамер, содержащий 2′-фтор-пиримидины и 2′-O-метил-пурины, ковалентно связанный с 40 кДа полиэтиленгликолем (PEG) для увеличения времени полужизни в кровотоке./div>

Пегаптаниб (Macugen) стал первым аптамерным терапевтическим агентом, одобренным FDA в декабре 2004 года. Он избирательно связывает VEGF165 — изоформу фактора роста эндотелия сосудов, ответственную за патологический ангиогенез и повышение сосудистой проницаемости при возрастной макулярной дегенерации. Пегаптаниб также стал первым антиангиогенным агентом, одобренным для лечения заболеваний глаз.

есмотря на успех, пегаптаниб имеет ограничения: он связывает только одну изоформу VEGF и уступает по эффективности моноклональным антителам (бевацизумаб, ранибизумаб). Тем не менее его одобрение стало доказательством концепции терапевтических аптамеров и открыло путь для последующих разработок. Вторым одобренным аптамером стал авацинкаптад пегол (Izervay) — также для лечения возрастной макулярной дегенерации.

В других терапевтических областях активно исследуются аптамеры для антикоагулянтной терапии. REG1 — система, состоящая из РНК-аптамера pegnivacogin (ингибитор фактора IXa) и антидота anivamersen, — прошла клинические испытания для применения при чрескожных коронарных вмешательствах. Хотя фаза II была преждевременно остановлена из-за аллергических реакций, концепция обратимого антикоагулянта на основе аптамера остаётся перспективной. ARC1779 — ДНК-аптамер к фактору фон Виллебранда — исследовался для лечения тромботической тромбоцитопенической пурпуры и болезни фон Виллебранда.

Другим направлением являются Spiegelmers — аптамеры, построенные из L-рибозы или L-дезоксирибозы, которые не распознаются природными нуклеазами и, следовательно, обладают исключительной стабильностью в биологических жидкостях. Несколько Spiegelmers (NOX-E36, NOX-H94, NOX-A12) вошли в клинические испытания.

Помимо терапевтического применения, аптамеры находят широкое применение в диагностике. Аптасенсоры — биосенсоры на основе аптамеров — обладают рядом преимуществ перед иммуносенсорами: они дешевле, стабильнее при хранении и могут быть регенерированы без потери активности.

Разработаны аптасенсоры для детекции широкого спектра биомаркеров, включая простат-специфический антиген (PSA) для диагностики рака предстательной железы, HER2/neu для рака молочной железы, муцин 1 (MUC1) для эпителиальных опухолей, тромбин для кардиоваскулярных заболеваний и амилоид-бета для болезни Альцгеймера.

Аптасенсоры реализуются в различных форматах: электрохимические (амперометрические, вольтамперометрические, импедиметрические), оптические (флуоресцентные, колориметрические) и на основе полевых транзисторов. Современные методы сигнальной амплификации позволяют достигать фемтомолярных и даже аттомолярных пределов обнаружения.

Перспективным направлением является интеграция аптасенсоров с машинным обучением для анализа сложных биологических образцов, что повышает надёжность диагностики и снижает количество ложноположительных результатов.

Несмотря на значительный прогресс, область аптамеров сталкивается с рядом вызовов. Одна из ключевых проблем — воспроизводимость результатов селекции. Некоторые широко используемые аптамеры, отобранные методом иммобилизации мишени, при тщательной проверке не подтверждают связывания, что привело к необходимости стандартизации методов оценки.

Другая проблема связана с поведением аптамеров в сложных биологических жидкостях. Аффинность, измеренная в буферных растворах, может существенно снижаться в сыворотке или плазме из-за конкуренции с белками, ионного состава и деградации нуклеазами. Это требует проведения селекции в условиях, максимально приближенных к физиологическим.

Для терапевтических аптамеров остаётся актуальной проблема доставки. Системное введение аптамеров ограничено их быстрой почечной фильтрацией и захватом фагоцитами. Решения включают конъюгацию с PEG (как в пегаптанибе), липидными наночастицами или targeting-молекулами.

Тем не менее перспективы аптамеров выглядят многообещающе. Их уникальные свойства — малый размер, низкая иммуногенность, возможность химической модификации и обратимость действия — делают их привлекательной альтернативой антителам в терапевтике и диагностике. Ожидается, что с развитием методов селекции, химической оптимизации и систем доставки число одобренных аптамерных лекарств будет расти, а аптасенсоры займут достойное место среди платформ для point-of-care диагностики.