Новости химической науки > РНК-интерференция: химический нож для генов

РНК-интерференция (RNAi) представляет собой эволюционно консервативный механизм подавления экспрессии генов с помощью малых некодирующих РНК. Впервые наиболее полно описанная Эндрю Файром и Крейгом Мелло в 1998 году (Нобелевская премия 2006 года), она играет ключевую роль в защите клетки от вирусной РНК и мобильных генетических элементов, а также в регуляции эндогенных генов. Центральным компонентом системы является индуцируемый РНК комплекс сайленсинга (RISC), содержащий белок Argonaute и направляющую РНК, которая обеспечивает последовательность-специфичное расщепление мРНК-мишени. Понимание молекулярных механизмов RNAi открыло путь к созданию терапевтических siРНК, способных «выключать» практически любой ген, и к разработке технологий доставки, преодолевающих барьеры организма. Сегодня РНК-интерференция — это не только мощный инструмент фундаментальной биологии, но и новая платформа для лечения ранее «недосягаемых» мишеней.

История РНК-интерференции началась с загадочных наблюдений в растительных системах. При попытке усилить окраску цветков петунии путём введения дополнительных копий гена халконсинтазы исследователи получили обратный эффект: цветки потеряли окраску или приобрели белые пятна. Сходные эффекты были обнаружены у грибов (явление «quelling» у Neurospora crassa) и при вирусной инфекции растений, где введение нетранслируемой версии вирусного гена также приводило к устойчивости. К середине 1990-х стало очевидно, что все эти феномены используют общий биохимический механизм.

В 1998 году Эндрю Файр и Крейг Мелло впервые наиболее полно описали РНК-интерференцию у нематоды Caenorhabditis elegans, показав, что двуцепочечная РНК вызывает эффективную и специфичную деградацию гомологичной мРНК. За это открытие они были удостоены Нобелевской премии по физиологии или медицине в 2006 году.

РНК-интерференция — это многоступенчатый процесс, в котором ключевую роль играют специализированные рибонуклеазы и белки-эффекторы.

Специализированные рибонуклеазы и РНК-связывающие белки управляют производством и действием малых регуляторных РНК. После первичного процессинга в ядре с участием Drosha предшественники микроРНК (pre-miRNA) транспортируются в цитоплазму, где расщепление Dicer генерирует зрелые микроРНК и малые интерферирующие РНК (siRNA).

Длинная двуцепочечная РНК (dsRNA) процессируется ферментом Dicer на дуплексы siRNA длиной примерно 21 нуклеотид с 2-нуклеотидными 3′-выступами. Этот размер критичен для эффективного связывания с эффекторными белками.

Дуплекс siRNA загружается на Argonaute 2 (Ago2) в процессе сборки RISC, формируя неактивный комплекс. Затем пассажирская цепь расщепляется и деградирует, оставляя активированный RISC, содержащий Ago2 и направляющую цепь. Этот комплекс связывается с комплементарной мРНК-мишенью, что приводит к расщеплению и деградации мРНК. В результате трансляция ингибируется, и экспрессия гена снижается. Активированный RISC перерабатывается для повторной сайленсинг-активности.

Двуцепочечные продукты сборки с Argonaute-белками обеспечивают преимущественный отбор одной цепи, которая используется для наведения последовательность-специфичного сайленсинга комплементарных мРНК-мишеней путём эндонуклеолитического расщепления или репрессии трансляции.

У некоторых организмов эффект РНК-интерференции усиливается и распространяется. Ген qde1 у Neurospora кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая может синтезировать дополнительные копии малых РНК, направляющих деградацию мРНК. Такая амплификация помогает объяснить, как RNAi распространяется по растениям и другим организмам. RISC сохраняется после расщепления мишени и может повторно использоваться на других копиях мРНК, что делает процесс каталитическим.

РНК-интерференция защищает клетку от чужеродной РНК, поддерживая в ней систему, аналогичную врождённому иммунитету. Предшественниками для siRNA служат двуспиральные формы вирусных РНК и РНК-копии мобильных генетических элементов. МикроРНК регулируют экспрессию не менее одной трети генов человека. Предшественниками для микроРНК служат двуспиральные длинные шпилькообразные клеточные РНК, и их процессинг проходит примерно по тому же пути, что и у siRNA. Таким образом, RNAi выполняет двойную функцию: защитную (борьба с вирусами и транспозонами) и регуляторную (тонкая настройка экспрессии собственных генов).

РНК-интерференция участвует в таких клеточных функциях, как формирование гетерохроматина, контролируемое удаление ДНК, защита от чужеродных нуклеиновых кислот и поддержание паттернов экспрессии с помощью консервативных белков.

РНК-интерференция широко используется как биотехнологический метод для изучения функций генов и может потенциально применяться как подход к генной терапии некоторых аутоиммунных, неопластических и инфекционных заболеваний.

«Классическая» РНК-интерференция связана с расщеплением и последующей деградацией целевой РНК, что в простейшей форме может быть осуществлено одним белком (Argonaute 2 у млекопитающих) и одной siRNA. Расщепление требует почти идеальной комплементарности между субстратом и малой направляющей РНК в комплексе; эта последовательная специфичность и каталитическая природа процесса создают почти идеальный инструмент для сайленсинга любого гена, для которого известна последовательность.

В отличие от очевидной эффективности RNAi in vitro, сайленсинг целевой экспрессии генов in vivo с помощью siRNA является очень сложной задачей из-за многоуровневых барьеров, включая быструю экскрецию, низкую стабильность в сыворотке крови, неспецифическое накопление в тканях, плохое клеточное поглощение и неэффективное внутриклеточное высвобождение.

Предыдущая работа в этой области решила проблему достижения экстрапечёночной доставки путём модуляции липидной химии и состава липидных наночастиц (LNP), что позволило предопределить доставку мРНК и машин редактирования генов в лёгкие и селезёнку мышей. Формулировки siRNA SORT LNP были оптимизированы для достижения мощной и длительной эффективности сайленсинга в печени и экстрапечёночных тканях, включая почки, лёгкие и селезёнку. Выбор дополнительного SORT-липида привёл к благоприятному профилю экстрапечёночного био распределения: 60% DOTAP50 LNP достигали лёгких, тогда как половина фракции DODAP-20 и 18PA-15 LNP направлялась в селезёнку. Наблюдение заметного флуоресцентного сигнала siRNA в почках (около 13%) стимулировало дальнейшее исследование возможного таргетинга почек.

Малые интерферирующие РНК обладают значительным терапевтическим потенциалом для избирательного сайленсинга ранее «недосягаемых» связанных с заболеваниями мишеней, открывая новые возможности для борьбы с болезнями человека. Эта терапевтическая стратегия, однако, ограничена неспособностью «голых» siRNA пассивно диффундировать через клеточные мембраны из-за их большого молекулярного размера и отрицательного заряда. Доставка siRNA в печень путём конъюгации с N-ацетилгалактозамином (GalNAc) оказалась успешной, обеспечивая мощный и длительный нокдаун генов, специфично в гепатоцитах. Однако плохая доставка и эффективность сайленсинга siRNA в других типах клеток сдерживали их применение за пределами печени. Способность нацеливаться на такие клинически значимые типы клеток за пределами печени открывает дверь для терапевтических siRNA-вмешательств для лечения хронических респираторных заболеваний, лёгочного фиброза, острого повреждения лёгких, рака лёгких и потенциально других заболеваний.

Несколько соображений ограничивают эффективность и специфичность РНК-интерференции. Прежде всего — наша текущая неспособность ограничить активность малых регуляторных РНК только этим путём расщепления РНК, что приводит к активации других клеточных регуляций, некоторые из которых имеют более низкий уровень последовательной специфичности, чем РНК-интерференция. Это может вызывать нежелательные побочные эффекты, известные как off-target эффекты.

Преодоление многоуровневых барьеров требует междисциплинарных подходов, включая химически модифицированные siRNA, вирусные векторы siRNA и невирусные носители. Повышенная специфичность и эффективность RNAi in vivo через селективное накопление в желаемых тканях, специфичное связывание с целевыми клетками и облегчённый внутриклеточный транспорт также достигаются с использованием таргетных молекул, клеточно-проникающих пептидов, фузогенных пептидов и стимул-чувствительных полимеров.

Хотя мРНК и siRNA имеют одинаковые строительные блоки (нуклеотиды), мРНК — это одноцепочечная, длинная и гибкая макромолекула, тогда как siRNA — двуцепочечная, более короткая и жёсткая. Оптимальное молярное соотношение липидов может быть различным для siRNA-формулировок, поскольку их vastly различные физико-химические атрибуты, связанные с размером и распределением плотности заряда, приводят к очень разной конформации и упаковке внутри LNP.

РНК-интерференция прошла путь от загадочных наблюдений ко-супрессии у растений до Нобелевской премии и одобренных лекарств. Молекулярный механизм, в котором Dicer и Argonaute orchestrate последовательность-специфичное расщепление мРНК, оказался универсальным и высокоэффективным. Терапевтический потенциал siRNA огромен — от лечения наследственных заболеваний до борьбы с раком и вирусными инфекциями.

Однако путь к клиническому применению остаётся сложным. Доставка siRNA в органы за пределами печени, минимизация off-target эффектов и обеспечение долговременного сайленсинга — ключевые задачи, над которыми работают исследователи. Развитие липидных наночастиц с селективным органным таргетингом (SORT) и химическая модификация siRNA вселяют оптимизм, что в ближайшие годы РНК-интерференция станет основой нового класса лекарств, способных лечить ранее «неизлечимые» болезни.